PROJENİN ADI:

UÇUCU KİMYASALLARLA DEPOLANMIŞ GIDALARIN (İrmik, maya, şeker) Drosophila melanogaster’DEKİ MUTAJENİK ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI

PROJENİN ÖZETİ:

Drosophila  melanogaster bilim dünyasında, hakkında en çok bilgi sahibi olduğumuz model canlılardan biridir.
Çalışmamızda, laboratuvar şartlarında oluşturduğumuz, havalandırılmamış bir dolap düzeneğinde (kapalı formaldehid, eter, metil ve metil alkol, propionik asit, etil şişeleri) 2 ay açık pakette tuttuğumuz, irmik, maya, şekerle hazırlanan besi yerinin sinek (Oregon tipi Drosophila melanogaster) üzerindeki mutajenik etkisi morfolojik özelliklerine bakılarak araştırılmıştır. Kontrol grubu olarak da yeni paketlenmiş ve satın alınmış taze irmik, maya ve şeker ile hazırladığımız besi yerinde yetişen sinekler kullanılmıştır.
45 günlük, üç nesil takibimiz sonucu kötü şartlarda depolanan gıdalarla oluşturduğumuz grup bireylerinin, kontrol bireylerine göre daha fazla morfolojik mutasyon geçirdiği tespit edilmiştir.
Çalışmamız, yanlış depolanan gıdaların mutajenik etkisini değerlendirmek için ileriye yönelik çalışmalarda bir model sistem olabilecektır.

PROJENİN AMACI:

Kimyasalların yanında saklanan besinlerin etkilişimini görmek özellikle de hafıfe alınmaması gereken biyolojik zararlarını ortaya koymak için Drosophila melanogaster  kullanarak bir model oluşturmak amaçlanmıştır.

 
(ONLİNE BAŞVURU FORMU ALANLARINDAN 1.İLGİLİ RESMİ VEYA ŞEKLİ EKLE ALANINDAN EKLENEN 1.ŞEKİL)

 Şekil 1 

GİRİŞ:

Drosophila melanogaster hayat döngüsü çok kısa olan bir canlıdır. Sirke sineği, meyve sineği de denilen bu tür özellikle Mendel genetiği dediğimiz temel genetik kuralları çalışılması için çok iyi bilinen ve çalışılan bir organizmadır. Laboratuvar çalışmaları için çok uygundur, 25 oC sıcaklıkta bütün metamorfozlarını 10-14 gün içinde tamamlayabilirler. Hayat döngüleri çok kısadır, buna rağmen yüksek oranda genetik çeşitliliğe sahiptirler. Hem ucuzdurlar, hem de yetiştirilmeleri çok kolaydır. Şekille (şekil 1) sineğin hayat döngüsü detayları verilmiştir.

Böylesine hızlı bir değişim sürecinde DNAnın kendini eşlemesi sırasında bir takım değişikler
Mutasyon, bir canlının DNA'sında, yani genetik bilgisinin saklı olduğu molekülde meydana gelen rastgele değişikliklerdir. Bir kütüphanedeki kitaplardan herhangi birine rastgele ve bilinçsizce harfler eklendiğinde veya harflerin yeri değiştiğinde nasıl o kitaptaki bazı kelimeler ve cümleler anlamını yitirecekse, mutasyon da DNA'da bilgi azaltıcı bir etki yapar.
Morfolojik mutasyonların yoğun olarak incelendiği canlılardan biri meyve sinekleridir (Drosophila melanogaster). Drosophila'ya uygulanan birçok mutasyondan birinde, gerçekte iki kanatlı olan meyve sineği ikinci bir çift kanada dahi sahip olmuştur

Genetikçilerin çok sevdiği sirkesineği Drosophila melanogaster "mütant" yani genetik varyantlarıyla özellikle çalışılmaktadır. Mütasyonların çoğunda sinek göreceli olarak az etkilenir. Örneğin "beyaz"la tanımlanan mütasyon, sineğin kırmızı yerine beyaz gözlü olmasına yol açar. Öte yandan daha önemli etkileri olabilen bir grup mütasyon da var. Bu "homeotik mütasyonlar"ın en iyi bilinen iki tanesinden biri olan "antennapedia" tipinde, sineğin kafasında antenler (duyargalar) yerine eksiksiz bir çift bacak büyümektedir. "Bithorax" adı verilen ikincisinde ise: Sineğin vücudunda bir yerine iki tane toraks (orta boğum) bulunur. Bu ise, orta boğumda içerilen organların tümünden ikişer tane olması anlamına gelir.
Moleküler genetikçilerin antennapedia ve bithorax'a neden olan genleri belirlemeleriyle. uygun yerdeki en basit mütasyonların bile bu garipliklere neden olabileceği ortaya çıkmıştır.
Gelişim sırasında sineğin hücrelerindeki konumsal algılama, büyük ölçüde sözkonusu genler tarafından denetlenmektedir. Sinekler, birbirlerine büyük benzerlikler gösteren, ama yine de farklılaşmış bir dizi boğumdan oluşur. Dolayısıyla farklı konumlardaki boğumlar, konumlarına uygun olan organı edinirler: Kafa boğumunda duyargalar, orta boğumdaysa bacaklar ve kanatlar oluşur. İşte homeotik mütasyonlar, boğumun bu konumsal kimliğinde karmaşaya neden olurlar. Yani konumsal genler, bir bacağı ya da duyargayı kodlayan bir grup genin aynı anda devreye girmesini sağlarlar. Buradan da görüleceği gibi gelişim, hiyerarşik bir denetim süreci: Denetim diziliminin üst düzeylerinde bulunan genler, dizilimin art düzeylerindeki birçok genin kaderini belirliyorlar. Sonuç olarak, denetleyici genlerde oluşması koşuluyla, tek bir gendeki küçük bir değişimin bile canlı üzerinde çok önemli bir etkisi olabiliyor. Çok miktarda genetik değişim olmaksızın da önemli morfolojik değişimler gerçekleşebilir.
  • MATERYAL ve METODLAR
    • MATERYAL
      • Drosophila melanogaster

Bu çalışma ve ileriye yönelik çalışmalarımız için Drosophila cinsi ve Drosophila melanogaster türünün çeşitli mutantları Carolina Biologicals Şirketinden getirtilmiştir.

      • Kimyasallar, Sarf Malzemeleri, Cihazlar
        • Drosophila besi ortamı

Besi ortamları ayda bir yenilenmiştir. Ayran şişeleri, pamuk, plastik pipet, suluboya fırçası, manyetik karıştırıcı, ısıtıcı, inkübatörler (200oC, 21oC), eter, besin ortamı hazırlamak için; Şeker 21.5g
Maya 11g
Agar 3.2g
İrmik 45g
Propionic acid 2.5ml (anti-fungal, mould inhibitörü)
Mikostatin 0.125g (anti-fungal)
Musluk Suyu 250ml


(ONLİNE BAŞVURU FORMU ALANLARINDAN 2.İLGİLİ RESMİ VEYA ŞEKLİ EKLE ALANINDAN EKLENEN 2.ŞEKİL)
Şekil 2: Normal ve mutant fenotip örnekleri.

YÖNTEM:
      • Deney düzeneğinin oluşturulması

Çeşitli uçucu kimyasal madde şişeleri ile (formaldehit, etil ve metil alkol, eter şişeleri) aynı kapalı ortama Drosophila melanogaster’ın besi ortamını hazırlayacağımız irmik, maya ve şekeri açık paketlerde koyduk. 2 ay süreyle bu ortamda beraber tuttuk. Bu ortam havalandırmasız bir ortamdır. Kimyasal şişelerinin ağızları kapalı da olsa belli bir miktar ortama bu kimyasallar sızmaktadır ve havalandırmasız bir yerde beraber bıraktığımız açık paket ürünlerin içine nüfuz etmektedir.

      • Drosophila melanogaster bakımı

Besi ortamları ayda bir yenilendi. Ayran şişeleri içine hazırlanan mamalarının hazırlanması aşağıdaki şekliyle.

  1. 250 ml musluk suyu+şeker+agar bir behere koyulur
  2. Sürekli karıştırılarak ısıtılır
  3. Karışım şeffaflaşınca irmik eklenir
  4. Yeterince katılaşınca ısıtma durdurulur
  5. Karışıma maya eklenerek karıştırılmaya devam edilir
  6. Mikostatin, propionik asit eklenir
  7. Karışım önceden 180oCde en az 1 saat sterilize edilmiş şişelere 1.5cm kalınlığında dökülür ve soğumaya bırakılır ağzı steril pamukla kapatılır.
  8. Şişelerin içlerinde oluşan buğu temizlenir ve 28oC’de inkübatörde en az bir gün bekletilir.
  9. Sineklerin nakli için bayıltılmaları gereklidir. Boş bir ayran şişesinin pamuğuna eter damlatılır, nakil şişesi ve sineklerin bulunduğu iki şişe ağızağıza getrilerek erişkin sineklerin boş şişeye geçmeleri sağlanır.
  10. Boş şişenin ağzı eterli pamukla kapatılır.
  11. Sineklerin bayılması beklenir.
  12. Suluboya fırçası ile baygın sineklerin yeni mamanın hazırlandığı şişeye şişe yana yatık vaziyette nakledilirler.
  13. Şişe sinekler tamamen ayılana kadar yan yatık şekilde kalmalıdır (sinekler mamaya yapışmasınlar diye).
  14. 21oC inkübatörde saklanırlar.
      • Deney gruplarının belirlenmesi

Deneyde kullanılan Drosophila melanogaster Oregon saf ırkıdır. Bu ırk Uludağ Üniversitesinden temin edilmiştir. Öncelikle Drosophilalar sayılarak kültür şişelerine aktarılmış ve burada belli aralıklarla gözlemlenmiştir. Görülen mutantlar mikroskop (diseksiyon mikroskobu) altında incelenmiş ve ayrı bir özel kaba alınmıştır. 

      • Drosophila melanogaster’ın mikroskop altında incelenmesi

Öncelikle drosophilaları durdukları özel fırından tek tek çıkarılmıştır.Daha sonra kültür şişelerindeki drosophilalar önceden hazırlanmış etherle bayıltılmıştır.5 dakika bekledikten sonra şişelerdeki drosophila’lar bir kâğıda dökülerek sayım işlemi gerçekleştirilmiştir.Sayım işlemi sırasında drosophilalara zarar gelmemesi için sulu boya fırçası kullanılmıştır.Sayım yaparken tespit edilen mutant türleri mikroskop altına alınarak incelenmiş,bunlardaki olağan dışı haller gözlenmiştir.Drosophilalar ayıldığında daha önce bir cam kaba yapıştırılan ve üzerine ether damlatılan peçete yardımıyla bayıltılmışlardır.Gözlem bittiğinde sirke sinekleri kültür şişelerine daha öncede kullanılan sulu boya fırçası yardımıyla aktarılmışlardır.Bundan sonrada 21 derecelik fırına geri konmuşlardır.

  • BULGULAR

Drosophila melanogaster’ın kimyasal maddelerle etkileşmiş gıdalarla beslenmesinin incelenmesi :

Kimyasal maddelerle etkileşmiş gıda ile yapılan mama iki kültür şişesine, yeni alınan ve başka kimyasal maddelerle etkileşmediğinden emin olduğumuz gıda ile yapılan mama da iki kültür şişesine ayrılmıştır. Bu şişelere saf Oregon ırkından drosophilalar aktarılmıştır.Yaptığımız 45 günlük gözlemler sonucunda  aşağıdaki bulgulara varılmıştır:
(Aşağıda bahsedilen 1. ve 2. kültür şişeleri, kimyasal maddelerle etkileşmiş besin ile , 3. ve 4. kültür şişeleri de yeni alınan besin ile hazırlanmıştır.)

F1 nesli:

 

drosophila SAYISI

mutant sayısı

1.kültür şişesi

  30

  2

2. kültür şişesi

  37

  3

3. kültür şişesi

  32

  0

4. kültür şişesi

  34

  1

F2 nesli:

 

drosophila SAYISI

mutant sayısı

1.kültür şişesi

 58

 4

2. kültür şişesi

 50

 5

3. kültür şişesi

 49

 1

4. kültür şişesi

 48

 1

 

 

 

F3 nesli:

 

drosophila SAYISI

mutant sayısı

1.kültür şişesi

 63

 6

2. kültür şişesi

 61

 6

3. kültür şişesi

 65

 2

4. kültür şişesi

 24

 1

Yukarıdaki fotoğraflar elde ettiğimiz morfolojik mutantların resimleridir. Özellikle kanatları gelişmemiş, kavrulmuş görüntülü ve abdomina kısmı anormal görülen çok sayıda mutant tespit ettik. Daha az sayıda büyük boy ve vücudu çok açık renkli mutant ve yine kanadı kesik tip mutantlar gözlemledik. Vücut renginde koyulaşma olmuş mutantlar da gözlemledik.

(ONLİNE BAŞVURU FORMU ALANLARINDAN 3.İLGİLİ RESMİ VEYA ŞEKLİ EKLE ALANINDAN EKLENEN 3.ŞEKİL)

SONUÇLAR VE TARTIŞMA:

Büyük şehirlerde hızlı kentleşme sebebiyle, yerleşim alanları sanayi bölgelerine yaklaşmakta, sanayi bölgelerindeki kimyasal maddeler iyi depo edilmemekte ve bundan dolayı da bu bölgelerden kimyasal maddeler çeşitli yollarla etrafa saçılmaktadır. Bu kimyasal maddeler hava yoluyla veya değişik bir yolla besinleri etkilemektedir. Hızlı kentleşme sebebiyle şehirler genişlemekte, insanların ihtiyaçlarını karşılamak için her yere büyük alışveriş merkezleri açılmaktadır.Sanayi bölgelerinin yerleşim alanlarına çok yakın olması sebebiyle alışveriş merkezlerinin bazıları da sanayi bölgelerine yakın yerlerde açılmaktadır.Bu tür alışveriş merkezlerinde satılan besinler buralara gelirken kimyasal maddelere maruz kalmaktadır.Çalışmamızı tetikleyen bir başka husus da büyük fabrikaların kimyasallarını denize dökerek çevreyi kirletmeleridir.Bunu yaparak büyük fabrikalar denizde yaşayan her türden canlıyı ve denize yakın olan her canlıyı olumsuz etkilemektedir.Balıklar bundan etkilendiği gibi bu balıkları yiyen insanlarda bundan etkilenir.Fabrikaların buna dikkat etmesi ve sanayi bölgelerinin yerleşim alanlarından uzak kalması gerekir.
Bizde bu sebeplerden yola çıkarak laboratuar ortamında yaptığımız çalışmalarla bir çok ülkede yaşanan bu tür olayların aslında ne kadar zararlı ve insanlığı tehtit eden bir unsur olduğunu gözler önüne sermeye çalıştık. Bu çalışmamızda drosophila melanogasteri kobay hayvan olarak kullandık. Kimyasalların yanında beklettiğimiz besinle hazırladığımız mamanın bulunduğu kültür şişelerindeki drosophilalar zamanla çeşitli mutasyonlara uğramışlardır.

Şekilde4 gözüken sinekler heat shock protein 70 geninde sıcaktan dolayı mutasyon oluştuğu zaman ortaya çıkan mutantların resimleridir. Bizim mutantlarımız da bu mutantlarla benzerlik göstermektedir. Bu da biz sineklerimizi yüksek ısıda bırakmadığımız için, bizim kullandığımız formaldehit, eter, etil ve metil eterin HSP70 geninde bir takım mutasyonlara sebep olabileceğini göstermektedir.
Sanayi alanlarının yerleşim merkezlerinden uzak olması gıdaların korunması bakımından önemlidir.
Kimyasal maddelerin ve gıda maddelerinin depo ortamlarının güvenli olması canlılar için çok önemlidir.

 
(ONLİNE BAŞVURU FORMU ALANLARINDAN 4.İLGİLİ RESMİ VEYA ŞEKLİ EKLE ALANINDAN EKLENEN 4.ŞEKİL)

KAYNAKLAR:

E.W. Sinnot, L. C.Dunn & Th. Dobzhansky(1958):Principles of Genetics.International Student Edition (5. ed).Mc Graw-hill,Kogakusha,Ltd.Tokyo.

J.David(1962): Drosophila Information Service.Vol.36,University of Oregon,Eugene,.

M.W.Strickberger (1962): Experiments in Genetics with Drosophila.John Wiley and sons Inc.New York.

M:Demerec & B.P.Kaufmann(1964): Drosophila Guide:Introduction to the genetics and Cytology of Drosophila melanogaster.(7.ed.), Carneige Institution of Washington.Washington D.C.

R.R.Sokal & F.J: Rohlf(1973):Introduction to Biostatics.W.H.Freeman and Company,San Francisco.

H.ünlü(1978): Drosophila melanogaster’de ömür uzunluğunun genetic denetimi.Doktora tezi.Hacettepe Üniversite.

A.Kençe (1979): Introduction to Drosophila Genetiği. Labaratuvar notları. O. D. T. Ü.

iris.cnice.mecd.es/.../ genetica/contenido9.htm
http://www.unlv.edu/Colleges/Sciences/Biology/Roberts/research.html